Den Gamle By blev oprettet i 1914 som et frilandsmuseum for de danske byers historie. Ambitionen var, at den besøgende skulle føle sig som ét med historien. Museet er i dag som en tidsrejse, hvor man kan gå i dialog med aktører fra forskellige historiske epoker: fra den førindustrielle købstad i 1700‑1800-tallet over de moderne tider i 1920’erne til 1970’ernes velfærdssamfund. Fra 2021 vil der tillige være et afsnit med fokus på året 2014.
Siden 1930’erne har stadig flere klassiske museumssamlinger fundet deres plads i Den Gamle By. Store landsdækkende samlinger og udstillinger af ure, sølvtøj, fajance og porcelæn, smykker, legetøj og plakater samt dragter og tekstiler indgår i dag i museet.
Siden 2011 har Den Gamle By også været lokalt bymuseum for Aarhus, og den interaktive tidsrejse Aarhus Fortæller viser med Aarhus som eksempel historien om en typisk dansk bys udvikling fra vikingetiden til i dag. Den Gamle By har tillige ansvaret for nyere tids kulturhistorie i Aarhus og Favrskov Kommuner. Sammen med Aarhus Universitet har Den Gamle By siden 2001 drevet forskningscenteret Dansk Center for Byhistorie. Museet driver også Besættelsesmuseet, der er indrettet i Aarhus gamle rådhus, der fra efteråret 1944 og frem til Befrielsen var hovedkvarter for det tyske sikkerhedspoliti, Gestapo.