I 1475 vendte den danske dronning Dorothea hjem fra Rom med Københavns Universitets grundlæggelsesdokument. Det er dateret d. 19. juni 1475, og i brevet tillod pave Sixtus 4., at der oprettedes et universitet i Danmark.
Universitetet indstiftedes ved en højtidelighed i Vor Frue Kirke i København d. 1. juni 1479 og universitetet lå indtil Reformationen i 1536 i byens rådhus. Fra begyndelsen var universitetet opdelt i de fire fakulteter teologi, jura, medicin og filosofi.
Efter Reformationen var universitetets hovedopgave at uddanne præster til den nye lutherske kirke i Danmark og Norge. For at kunne løfte opgaven tildeltes universitetet ad flere omgange store godser, herunder også biskoppen af Roskildes residens ved Vor Frue Kirke, hvor universitetets hovedbygning i dag er placeret.
Universitetets økonomiske uafhængighed efter Reformationen modsvaredes af et stærkt selvstyre – meget senere kaldet professorvælde – som udøvedes via Konsistorium og varede ved indtil Universitetsstyrelsesloven af 1970. Konsistorium har mødtes i Konsistoriehuset siden 1563, og mange af Danmarks (og Norges) berømte videnskabsmænd og kulturpersonligheder har siddet med, således fx Ole Rømer, Ludvig Holberg, H.C. Ørsted, Adam Oehlenschläger og Niels Bohr.
Undervisningssproget var i middelalderen og helt frem til midten af 1700-tallet latin, hvorefter tysk og fransk fik større betydning. Overgangen til dansk som undervisningssprog skete i 1800-tallet.
I løbet af 1700-tallet udvikledes et system af embedseksaminer. Først kom kandidateksamen i jura samt eksamen til dansk jurist i 1736. Det afspejler, at universitetet efterhånden også uddannede andre embedsmænd end præster til statens tjeneste. En ny universitetsfundats af 5. maj 1788, bl.a. med en ny eksamensordning og en forøgelse af antallet af lærere, markerede formelt, at Københavns Universitet var på vej til at blive en moderne forsknings- og undervisningsinstitution.
